Môi trường nuôi cấy là gì? Các công bố khoa học về Môi trường nuôi cấy

TÓM TẮT: Giới thiệu một môi trường nuôi cấy cải tiến cho vi khuẩn lactobacilli. Môi trường này hỗ trợ sự phát triển tốt của lactobacilli nói chung, và đặc biệt hữu ích cho một số chủng nhạy cảm chỉ phát triển kém trong các môi trường chung khác. Ngoài ra, trong môi trường này không cần sử dụng nước ép cà chua, một nguyên liệu có sự biến đổi cao. Khi được điều chỉnh một chút, môi trường này cũng có thể được sử dụng như môi trường cơ bản cho các thử nghiệm lên men.

Tỉ lệ sống sót, p, của một mẫu cấy được đo của Staph. aureus trong một thể tích tiêu chuẩn của máu đã được loại bỏ tiểu cầu, là một thước đo định lượng đáng tin cậy của sức mạnh diệt khuẩn của máu. Số lượng vi sinh vật sống trong mẫu cấy và trong hỗn hợp máu-khuẩn có thể được ước tính với độ chính xác cần thiết bằng cách đếm số lượng thuộc địa phát triển từ các thể tích đo được của chất lỏng được cho lên bề mặt của môi trường rắn. Agar Fildes là môi trường thích hợp nhất cho việc đếm số lượng sống trên bề mặt này, và nó được chọn dựa trên bốn tiêu chí; trong số các môi trường đã thử nghiệm, nó cho số lượng cao nhất, và số lượng này phù hợp nhất với chuỗi Poisson; và trên đó, kích thước thuộc địa trung bình là tối đa, và hệ số biến thiên kích thước thuộc địa là tối thiểu. Trên môi trường này, sự phù hợp chặt chẽ của các giá trị đếm riêng lẻ với chuỗi Poisson cho phép xác định sai số chuẩn của tỉ lệ sống sót từ một sự giản lược của biểu thức tổng quát cho sai số chuẩn của một tỉ lệ.

Số lượng thuộc địa phát triển từ một mẫu hỗn hợp máu-khuẩn có thể bị giảm, không phải do việc tiêu diệt từng vi khuẩn, mà là do sự kết tụ của chúng, hoặc bởi các agglutinin trong máu, hoặc trong bào tương của các bạch cầu có khả năng thực bào nhưng không diệt khuẩn. Có vẻ như những cơ chế này khó có khả năng hoạt động trong hỗn hợp máu-khuẩn có chứa một số lượng vi sinh vật tương đối ít; trong những hỗn hợp như vậy, tỉ lệ sống sót chỉ phản ánh sức mạnh diệt khuẩn.

Hệ thống nuôi cấy lỏng được mô tả nhằm duy trì sự gia tăng tế bào gốc huyết học (CFU‐S), sản xuất tế bào tiền thân hạt (CFU‐C), và quá trình tạo hạt rộng rãi có thể được duy trì in vitro trong vài tháng. Những văn hóa này bao gồm các quần thể tế bào dính và không dính. Quần thể dính chứa các tế bào đơn nhân thực bào, các tế bào “biểu mô”, và các tế bào “mỡ khổng lồ”. Các tế bào sau có vẻ đặc biệt quan trọng cho việc duy trì tế bào gốc và hơn nữa, có xu hướng mạnh mẽ cho các tế bào hạt trưởng thành chọn lọc tụ tập ở và xung quanh các khu vực của sự tập trung tế bào “mỡ khổng lồ”. Bằng cách “nuôi dưỡng” các văn hóa ở các khoảng thời gian hàng tuần, giữa 10 đến 15 “sự gấp đôi quần thể” của CFU‐S hoạt động bình thường thường xuyên xảy ra. Sự gia tăng “gấp đôi quần thể” có thể đạt được bằng cách nuôi dưỡng hai lần mỗi tuần. Các văn hóa cho thấy quá trình tạo hạt rộng rãi ban đầu theo sau, trong đa số các trường hợp, là sự tích lũy của các tế bào blast. Cuối cùng cả tế bào blast và tế bào hạt đều giảm và các văn hóa chủ yếu chứa các tế bào đơn nhân thực bào.

Nuôi cấy ở 33°C dẫn đến sự phát triển phong phú hơn của các tế bào dính và các văn hóa này cho thấy khả năng duy trì tế bào gốc tốt hơn và mật độ tế bào tăng.

Khi được thử nghiệm về hoạt động kích thích thuộc địa (CSA), các văn hóa đều có kết quả âm tính. Thêm CSA ngoại sinh gây ra sự suy giảm nhanh chóng của tế bào gốc, giảm quá trình tạo hạt và sự tích lũy của các tế bào đơn nhân thực bào.

Mối quan hệ giữa sự tăng sinh tế bào và biểu hiện tạm thời của các gen đặc trưng cho một chuỗi phát triển liên quan đến sự phân hóa của tế bào xương đã được xem xét trong các văn hóa tế bào diploid nguyên phát của tế bào tạo xương lấy từ vỏ sọ thai nhi bằng cách sử dụng kết hợp hình ảnh tự phóng xạ, hóa sinh, hóa học mô và các thí nghiệm mRNA về sự tăng trưởng của tế bào tạo xương và các gen kiểu hình. Những thay đổi trong biểu hiện gen xác định một chuỗi phát triển có 1) ba giai đoạn chính: tăng sinh, sự trưởng thành của matrik ngoại bào và khoáng hóa; và 2) hai điểm kiểm soát mà tế bào có thể tiến triển nhưng không thể qua được mà không có dấu hiệu thêm: điểm đầu tiên là khi sự tăng sinh bị điều chỉnh giảm và biểu hiện gen liên quan đến sự trưởng thành của matrik ngoại bào được kích thích, và điểm thứ hai là khi xảy ra khoáng hóa. Ban đầu, các tế bào đang tăng sinh tích cực, biểu hiện các gen điều chỉnh chu kỳ tế bào và tăng trưởng tế bào, sản xuất một matrik ngoại bào loại fibronectin/collagen loại I. Một mối quan hệ đối kháng và kết hợp chức năng giữa sự suy giảm hoạt động tăng sinh và sự kích thích tiếp theo của các gen liên quan đến sự trưởng thành của matrik và khoáng hóa được hỗ trợ bởi 1) một chuỗi sự kiện tạm thời mà trong đó có sự biểu hiện tăng cường của phosphatase kiềm ngay sau giai đoạn tăng sinh, và sau đó là sự biểu hiện tăng của osteocalcin và osteopontin vào thời điểm bắt đầu khoáng hóa; 2) sự biểu hiện tăng của một tập hợp cụ thể các dấu hiệu kiểu hình tế bào tạo xương, bao gồm phosphatase kiềm và osteopontin, khi sự tăng sinh bị ức chế bởi hydroxyurea; và 3) mức độ biểu hiện của các dấu hiệu tế bào tạo xương tăng cường theo một chức năng của việc lắng đọng collagen được kích thích bởi acid ascorbic, gợi ý rằng matrik ngoại bào góp phần vào cả việc ngưng hoạt động tăng sinh và sự phát triển kiểu hình tế bào tạo xương.

Nhiều hiểu biết của chúng ta về các cơ chế sinh học nằm dưới các chức năng tế bào, chẳng hạn như sự di chuyển, phân hóa và cảm nhận lực đã được thu thập từ việc nghiên cứu các tế bào được nuôi cấy trên bề mặt kính hoặc nhựa hai chiều (2D). Tuy nhiên, gần đây, lĩnh vực sinh học tế bào đã nhận thức được sự khác biệt giữa các bề mặt phẳng này và các môi trường ngoại bào ba chiều (3D) phức tạp về địa hình mà các tế bào hoạt động thường xuyên trong cơ thể. Điều này đã thúc đẩy những nỗ lực đáng kể trong việc phát triển các môi trường sinh học mô phỏng 3D trong phòng thí nghiệm và khuyến khích nhiều công việc liên ngành giữa các nhà sinh học, nhà khoa học vật liệu và kỹ sư mô. Khi chúng ta tiến tới các hệ thống nuôi cấy mang tính sinh lý hơn để nghiên cứu các quá trình tế bào cơ bản, việc xác định chính xác các yếu tố đang hoạt động trong các vi môi trường 3D là điều rất quan trọng. Do đó, trọng tâm của bài bình luận này sẽ là xác định và mô tả các đặc điểm cơ bản của các hệ thống nuôi cấy tế bào 3D ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, sự bám dính, chuyển đổi tín hiệu cơ học và tín hiệu phản ứng với các yếu tố hòa tan, mà – trở lại – điều chỉnh chức năng tế bào tổng thể theo những cách hoàn toàn khác biệt so với các định dạng nuôi cấy 2D truyền thống. Thêm vào đó, chúng tôi sẽ mô tả các kịch bản thí nghiệm trong đó nuôi cấy 3D đặc biệt phù hợp, làm nổi bật những bước tiến gần đây trong kỹ thuật vật liệu để nghiên cứu sinh học tế bào, và thảo luận về các ví dụ trong đó việc nghiên cứu tế bào trong bối cảnh 3D đã cung cấp những hiểu biết mà sẽ không được quan sát thấy trong các hệ thống 2D truyền thống.

Kháng methicillin ở Staphylococcus aureus đã được liên kết với sự thay đổi trong các protein liên kết penicillin (PBP). Một đặc tính thú vị của tất cả các loại tụ cầu kháng methicillin là sự phụ thuộc khả năng kháng vào giá trị pH của môi trường nuôi cấy. Sự phát triển của vi khuẩn này ở pH 5,2 hoàn toàn ngăn chặn sự biểu hiện của khả năng kháng methicillin. Chúng tôi đã kiểm tra các mẫu PBP của các tụ cầu kháng methicillin phát triển ở pH 7,0. Chúng tôi đã phát hiện một PBP có khối lượng phân tử lớn (PBP-2a; kích thước xấp xỉ 78.000 Dalton) chỉ xuất hiện ở vi khuẩn kháng nhưng không có ở chủng nhạy cảm tương đồng. Trong các mẫu nuôi cấy ở pH 5,2, PBP bổ sung này không thể được phát hiện.

Matrigen ngoại bào (ECM) là một yếu tố quyết định trong việc phát triển mô và duy trì sự ổn định của nó. "Môi trường vi mô được thiết kế" trong các mô hình nuôi cấy và in vivo đã chỉ ra rằng ECM kiểm soát sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis ở các tế bào biểu mô vú (MEC) của chuột và người thông qua một hệ thống thứ bậc các sự kiện phiên mã có liên quan đến sự tương tác phức tạp giữa các con đường tín hiệu hòa tan và vật lý. Hơn nữa, các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các con đường này chỉ đạo và bị ảnh hưởng bởi cấu trúc mô. Cấu trúc mô được điều hướng bởi các tương tác hợp tác giữa các tế bào và có thể được điều chỉnh bởi các yếu tố mô đệm. Do đó, không có gì ngạc nhiên khi sự mất cấu trúc mô và các thay đổi trong các thành phần ECM liên quan đến sự xuất hiện và phát tán của các khối u vú, và sự ác tính liên quan đến những rối loạn trong sự kết dính tế bào, sự thay đổi của các phân tử kết dính và phản ứng mô đệm. Một số bằng chứng hiện nay hỗ trợ giả thuyết rằng quá trình bệnh sinh của ung thư vú được xác định (ít nhất một phần) bởi sự tương tác động lực giữa các tế bào biểu mô ống dẫn, môi trường vi mô và cấu trúc mô (acini). Do đó, để hiểu rõ các cơ chế liên quan đến sự hình thành ung thư, vai trò của môi trường vi mô (ECM cùng với các tế bào mô đệm) đối với cấu trúc mô cần phải được xem xét và nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã thiết lập một mô hình MEC người độc đáo về quá trình hình thành khối u, mô hình này kết hợp với một xét nghiệm nuôi cấy ba chiều, tái hiện nhiều thay đổi di truyền và hình thái quan sát được ở ung thư vú in vivo. Hiện tại, chúng tôi đang sử dụng hệ thống này để hiểu vai trò của môi trường vi mô và cấu trúc mô trong sự tiến triển của ung thư vú.

Các tế bào cơ trơn (SMC) thể hiện tính linh hoạt chức năng, điều chỉnh từ kiểu hình trưởng thành, trong đó chức năng chính là co bóp, đến trạng thái ít phân biệt hơn với khả năng tăng cường về khả năng vận động, tổng hợp protein và tăng sinh. Nghiên cứu hiện tại đã xác định, sử dụng phân tích Western, miễn dịch huỳnh quang kép và kính hiển vi huỳnh quang hội tụ, liệu sự thay đổi trong biểu hiện kiểu hình của tế bào SMC động mạch chủ thỏ trong nuôi cấy có thể được kết hợp với sự thay đổi trong biểu hiện và phân bố của các protein cấu trúc. Tế bào SMC ở trạng thái "co bóp" (ngày 1 và 3 của nuôi cấy sơ cấp) cho thấy sự phân loại rõ rệt các protein vào các miền tế bào, nhất quán với lý thuyết rằng cơ chế cấu trúc SMC được phân chia trong tế bào. Các protein chuyên biệt cho việc co bóp (α-SM actin, SM-MHC, và calponin) được biểu hiện cao trong các tế bào này và tập trung ở vùng trung tâm trên cùng của tế bào. Vimentin được giới hạn ở thân tế bào, cung cấp hỗ trợ cho thể co bóp nhưng không đồng thời phân bố với nó. Theo vai trò của nó trong gắn kết tế bào và vận động, β-NM actin được định vị ở ngoại vi tế bào và vỏ đáy. Protein cơ thể dày α-actinin được tập trung ở ngoại vi tế bào, có thể ổn định cả cơ chế co bóp và vận động. Các điểm nối chứa vinculin phát triển tốt, cho thấy sự bám dính mạnh của tế bào vào nền. Ở trạng thái "tổng hợp" SMC (các thí nghiệm từ 2-3 lần nuôi cấy), có sự giảm biểu hiện của các protein co bóp và protein gắn kết (vinculin) đi kèm với sự gia tăng các protein cytoskeletal (β-non-muscle [NM] actin và vimentin). Những thay đổi định lượng này trong các protein cấu trúc có liên quan đến những thay đổi mạnh mẽ về sự phân bố của chúng. Sự phân chia đặc trưng của các protein cấu trúc được quan sát thấy ở SMC trạng thái "co bóp" không còn rõ ràng nữa, với các protein phân phối đều hơn trong bào tương để thích ứng với sự thay đổi chức năng của tế bào. Vì vậy, việc điều chỉnh kiểu hình SMC không chỉ liên quan đến sự thay đổi định lượng trong các protein co bóp và cytoskeletal, mà còn là sự tổ chức lại các protein này. Do cytoskeleton hoạt động như một yếu tố điều chỉnh không gian của tín hiệu nội bào, sự tổ chức lại của cytoskeleton có thể dẫn đến việc định hình lại các phân tử tín hiệu, điều này có thể dẫn đến các thay đổi trong chức năng liên quan đến điều chỉnh kiểu hình SMC.

Propionibacterium freudenreichii được sử dụng như một chất khởi đầu trong quá trình ủ phô mai và như một loại probiotic. Các tác động sinh lý đã được báo cáo của nó ở cấp độ ruột, bao gồm việc điều chỉnh bifidobacteria, sự tăng sinh và apoptosis của tế bào biểu mô ruột, và viêm ruột, phụ thuộc vào sự chuyển hóa hoạt động in situ . Khả năng sống sót và hoạt động vì vậy là những yếu tố then chốt quyết định hiệu quả của nó, tạo ra thách thức về thích ứng với căng thẳng và dung nạp cho các ứng dụng probiotic. Môi trường nuôi cấy và điều kiện tăng trưởng xác định việc tiếp thu dung nạp. Chúng tôi đã nghiên cứu khả năng sử dụng whey ngọt, một sản phẩm phụ từ sữa, để duy trì P. freudenreichii trong quá trình tăng trưởng. Nó được sử dụng ở các nồng độ khác nhau (chất rắn khô) như một môi trường nuôi cấy. Sử dụng whey ngọt siêu đậm đặc dẫn đến việc gia tăng khả năng chịu đựng đa căng thẳng, sự biểu hiện quá mức của các protein chịu stress chính, và sự tích lũy các phân tử lưu trữ nội bào và các solute tương thích, cũng như tăng cường khả năng sống sót trong quá trình phun khô. Một quy trình đơn giản hóa từ sự phát triển đến việc phun khô propionibacteria đã được phát triển sử dụng whey ngọt như một môi trường 2-trong-1 vừa nuôi cấy P. freudenreichii vừa bảo vệ nó khỏi bị tổn thương nhiệt và thẩm thấu mà không cần các bước thu hoạch và rửa. Do phun khô rẻ hơn và tiết kiệm năng lượng hơn so với đông khô, công trình này mở ra những triển vọng mới cho sự phát triển bền vững của các chế phẩm khởi đầu và probiotic mới với độ bền cao hơn.

Ý NGHĨA Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh rằng whey ngọt, một sản phẩm phụ của ngành công nghiệp sữa, không chỉ cho phép sự phát triển của các propionibacteria dairy probiotic, mà còn kích hoạt một phản ứng đa dung nạp thông qua thích ứng thẩm thấu và phản ứng căng thẳng tổng quát. Chúng tôi cũng chỉ ra rằng các propionibacteria tích lũy solute tương thích trong các điều kiện nuôi cấy này, có thể giải thích cho sự mất mát độ sống sót hạn chế sau quá trình phun khô. Công trình này mở ra những triển vọng mới cho việc sản xuất các chế phẩm khởi đầu và probiotic từ sữa với hiệu quả năng lượng cao hơn.